Повишените серумни несвързани анти-еластинови IgG антитела са свързани с акцелериране на атерогенезата при болни със захарен диабет тип 2 и артериална хипертония

Задебеляването на базалната мембрана на капилярите и малките съдове е добре позната находка и важен компонент в прогресията на диабетната микроангиопатия

Цели: Задебеляването на базалната мембрана на капилярите и малките съдове е добре позната находка и важен компонент в прогресията на диабетната микроангиопатия. Пациентите със захарен диабет и артериална хипертония са в по-висок риск за акцелериране на атерогенезата.Целите на настоящето проучване са:(1) да определим дали серумните нива на “свободните” несвързани в ЦИК еластинови антитела (НЕА) корелират с развитието съдови увреждания при пациенти с тип 2 захарен диабет и артериална хипертония; (2) да проверим дали съществува връзка между нивата на НЕА и липиден профил

Материал и методи: Използвахме метод за детектиране на имунни комплекси (комплемент инхибиращ фактор: КИФ-ензим свърана имуносорбентна проба) в комбинация с ELISA за откриване на ЕА. Нивата на НЕА клас IgG бяха изследвани в серуми на 93 пациенти с тип 2 захарен диабет (Т2ЗД) и артериална хипертония (АХ) (средна възраст 61.4±11.3, продължителност на диабета 9.88±3.12; продължителност на хипертонията 9.28±4.98). Тези нива бяха сравнени с тези на 42 контролни лица съвпадащи по пол и възраст. Диабетиците бяха разделени на две групи в зависимост от наличието- Група 1 (n=67) или отсъствието- Група 2 (n=26) на микроангиопатия.

Резултати: Несвързаните ЕА пациенти със Т2ЗД и АХ са статистичски значимо по-високи в сравнение с контролите (0.42±0.04 vs. 0.24±0.02) (р=0.0009). Група 1 показа сигнификантно завишение на несвързани ЕА спрямо здрави индивиди (0.41±0.02 vs. 0.24±0.02) (р=0.0003). Група 2 също показа завишение на серумни несвързани ЕА спрямо контролната група (0.37±0.04 vs. 0.24±0.02) (р=0.001). Несвързаните еластинови антитела корелират с нивата на HbA1c (r=0.22); (p=0.04), общият холестерол (r=0.33); (p=0.05), триглицеридите (r=0.38); (p=0.03), и микроалбуминурията (r=0.41); (p=0.002).

Заключение:Повишените серумни нива на НЕА IgG са свързани с развитието на съдови увреждания при диабетици с артериална хипертония. Вероятно НЕА IgG са добър маркер за определяне на съдовите поражения при диабетици с артериална хипертония. Нашите резултати показват, че НЕА IgG играят роля и в акцелерирането на атерогенезата при диабетици с артериална хипертония.

Ключови думи: Захарен диабет тип 2, артериална хипертония, комплемент инхибиращ фактор КИФ-ензим свързана имуносорбентна проба, несвързани антиеластинови антитела, съдови увреждания.

Въведение

Хипертонията или високото артериално налягане засяга около 600 млн. хора по целият свят. Артериалната хипертония се среща приблизително два пъти по-често при пациентите със захарен диабет в сравнение с популацията без диабет[1]. Това подкрепя доказателството, че хипертонията свързана с диабет представлява рисков фактор за увреждане както на големите, така и на малките съдове[2].

Както есенциалната хипертония, така и захарният диабет засягат главни таргетни органи. Общият знаменател на хипертензивната/диабетната таргетна органна-болест е съдовото дърво. Хипертrофията на лявата камера и коронарната артериална болест се срещат много по-често при хипертензивни диабетици отколкото при пациентите страдащи самостоятелно от диабет или хипертония. Едновременното наличие на диабет и хипертония ускорява увреждането на реналната функция, развитието на ретинопатия и развитието на цереброваскуларни инциденти[3].

Застъпването на артериалната хипертония със захарен диабет значимо повишава риска за исхемична цереброваскуларна болест, ретинопатия и сексуална дисфункция[4]. Захарният диабет е независим рисков фактор за коронарна артериална болест, а рискът значително се повишава когато е налице и хипертония.

Въпреки че, до момента има множество данни за патогенезата на процеса, малко информация е налична относно ролята на имунната система в аспекта на съдовите лезии при тези пациенти. Тяхната роля нараства при пациенти с хипергликемия или захарен диабет тип 2. Следствие на хипертонията е и акцелериларата атеросклероза.

Еластичните фибри отговарят за къмплайанса и еластичността, като са организирани в еластични ламели. Тези структури разделят слоевете от гладкомускулни клетки и разпределят напрежението еднородно по цялата съдова стена. Деградацията на еластичните фибри или калцификацията им при много заболявания засягащи съдовете с малък калибър води до васкуларна увреда. Нашите предишни изследвания при пациенти със захарен диабет тип 1 с микроангиопатия[5,6] установиха, че съществува повишена деградация на еластин- главният протеин на еластичните фибри. Вследствие на това, разтворими еластин-деградационни пептиди (ЕДП) се установяват в циркулацията, представлявайки патологичен стимул за образуването на антиеластинови антитела (ЕА)[6,7,8].

Материал и методи

В наши предишни изследвания използвахме метод базиран на С3 свързващ гликопротеин: КИФ-ензим свързана имуносорбентна проба (ELISA) (разработена от Станилова и Славов[9]. Методът беше използван за определяне на ЦИК (IgG, IgМ и IgА) в серуми на диабетици[10]. Открихме корелация между ЦИК от клас IgG и развитието на съдови увреждания. В настоящето проучване ние използвахме КИФ-ELISA, комбинира с ELISA за определяне на ЕА със следните стъпала: (а) eлиминиране на ЕА, които са инкорпорирани в ЦИК; (б) измерване на серумните нива на IgG несвързани в ЦИК антиеластинови антитела (НЕА);  (в) тестване на възможна корелация между НЕА IgG и развитието на микроваскуларни увреждания при пациенти с диабет и артериална хипертония.   

За контроли са използвани човешки серуми на 42 клинично здрави субекти със средна възраст 58.9±7.56. Подбрани са индивиди, наследствено необременени с артериална хипертония, захарен диабет и атеросклероза, без възпалителни процеси, колагенози, емфизем и да не са преболедували от хепатит. Техните рутинни параклинични изследвания, липидограма и серумни белтъци са без промени, а ЕКГ е нормална. Освен клинически здравите лица са изследвани и 93 пациенти със захарен диабет тип 2 и артериална хипертония със средна възраст 61.4±11.3 и продължителност на захарният диабет тип 2 9.88±3.12 и на артериална хипертония 9.28±4.98 г. Всичките са от региона на Медицински университет гр. Плевен. Диабетиците бяха разделени на две групи в зависимост от наличието - Група 1 (n=67) или отсъствието - Група 2 (n=26) на микроангиопатия (Табл. 1). Беше получено етично одобрение от етичната комисия и пациентите подписаха информирано съгласие за участие в проучването.

Всичките пациенти с диабет са изследвани от един и същ офталмолог чрез офталмоскопия на разширени зеници.

• Гликираният хемоглобин беше измерен чрез използването на високо афинитетна течна хроматография (нормални граници 4-6%).
• За установяване на плазмената глюкоза, кръвта беше събрана в епруветки с гликолитичен инхибитор, и анализирана в рамките на 3-4 h в централна лаборатория чрез глюкозо-оксидазния метод GOD-PAP (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) с Hitachi 705 автоанализатор (Boehringer Mannheim).
• Общият серумен холестерол и концентрациите на триглицеридите бяха измерени чрез ензимен анализ (Boehringer Mannheim).
• Артериалното кръвно налягане беше измерено чрез стандартен живачен сфигмоманометър с разлика до 2 mm Hg, на доминиращата ръка в супинация след най-малко 10 min почивка.
• AER беше определена чрез нефелометрия използвайки кит съдържащ специфично антитяло (Behringwerke, Marburg, Germany).

Антиген

Антиген разстворим α-еластин беше приготвен от аорта на здрави субекти (загинали при инцидент) по описания начин Nicoloff et al., 2000[11]. Еластиновата чистота беше потвърдена чрез аминокиселинен анализ от Проф. Р. Мекам (Вашингтонски университет, Ст. Луис, МО). Несвързаните  ЕА бяха определени чрез използването на двустепенен метод включващ: КИФ-ELISA за отстраняване на имунните комплекси, последван от еластин-специфична ELISA за определяне на ЕА.

КИФ-ELISA плаките бяха приготвени чрез инкубиране на кладенчетата с КИФ (20 μg/ml в 0.2 M карбонат-бикарбонатен буфер pH 9.6 през нощта на 4^oC). КИФ беше изолиран от семената на  паразитното растение  Cuscuta europea. След няколко кратни промивки за отстраняване на несвързаният КИФ, човешките проби (100 μl) бяха прибавени към плаките и инкубирани за 60 min на 37^o C. В края на инкубационният период, пробите бяха прехвърлени от КИФ плаката към кладенчетата сенсибилизирани с аортен α-еластин (1 μg oт еластин в 100 μl от 0.05 M карбонатен буфер, pH 9.6) по описания по-рано начин (7). Тези проби бяха след това инкубирани за 1 h на 37 °C, няколкократно промити и свързаното антитяло беше открито с кози античовешки IgG пероксидазни конюгати разредени 1:10 000 с PBS cъдържащ 1% говежди серумен албумин (BSA) и  0.05% Tween 20 и о-фениленедиамин, 4 mg/ml в 10 ml  0.05 M цитртен буфер, pH 5.0+0.01% H₂O₂ за 1 h на стайна температура в тъмна камера.

Реакцията беше спряна с добавянето на 4M H₂SO₄ към всяко кладенче. Оптичната плътност беше измерена чрез Microelisa Reader 210 (Organon Teknika, Turnhout, Belgium) при дължина на вълната 492 nm.

Контроли:

(1)     Субстратна контрола: субстратният разтвор беше прибавен директно към плаките с еластин;

(2)     имуноконюгатна контрола: IgG имуноконюгат беше тестван върху полистироловите кладенчета сенсибилизирани с BSA и върху кладенчета сенсибилизирани с други човешки имуноглобулини (IgM, IgA и IgD);

(3)     инхибиране на ELISA: 10 серумни проби с най-високите нива на ЕА бяха преинкубирани със 100 μg човешки α-еластин  за 30 min на 37^o C; сместа беше след това центрофугирана за 30 min на 15 000 g, и бяха използвани супернатанти за ELISA според обичайния протокол и

(4)      КИФ-ELISA контрола:  след абсорбцията на IgG ЦИК от CIF, 100 μl от абсорбиран серум беше тестван за наличието на IgG ЦИК.

Всичките проби бяха трикратно тествани и периферните кладенчета не бяха използвани за да се избегнат граничните ефекти.

Статистически методи

Данните от проучванията са обработени с компютърните програми EXCEL (Microsoft Corporation, Redmond, WA) и STATGRAPHICS plus (Manugistics, Rockville, MD) за WINDOWS. Резултатите са описани чрез таблици, графики и числови величини (средна аритметична)±2D; показатели за относителен дял и корелационни коефициенти). За изводи и заключения при нормално разпределение на случаите са използвани t – тест на Стюдент, F - тест на Фишер (ANOVA) и post-hoc тестовете (LSD, Tukey HSD, Scheffe, Bonferroni, Newman-Keuls, and Duncan) а при различно от нормалното разпределение

      K-W (Kruskal-Wallis) – тест. Значимостта на резултатите е определена като p

Резултати

За да определим дали ЦИК IgG са отстранени успешно, ние тествахме пробите след абсорбция с КИФ-ELISA за наличие на ЦИК IgG. Не беше установено значимо повишение в нивата на ЦИК IgG в сравнение с имуноконюгатната контрола от КИФ-ELISA. Несвързаните ЕА при пациенти със ЗД тип 2 и АХ са статистичски значимо по-високи в сравнение с контролите (0.42±0.04 vs. 0.24±0.02) (р=0.0009). Група 1 показа сигнификантно завишение на несвързани EA спрямо здрави индивиди (0.41±0.02 vs. 0.24±0.02) (р=0.0003). Група 2 също показа завишение на серумни несвързани EA спрямо контролната група (0.37±0.04 vs. 0.24±0.02) (р=0.001)(Табл. 2) (Фиг. 1).

Несвързаните еластинови антитела корелират с нивата на HbA1c (r=0.22); (p=0.04), общият холестерол (r=0.33); (p=0.05), триглицеридите (r=0.38); (p=0.03), и микроалбуминурията (r=0.41); (p=0.002).

Дискусия

Артериалната хипертония е свързана с намаление на съдовия еластицитет, увеличена съдова ригидност и абнормално повишение на отношението колаген/еластин. Тези промени са в резултат от промененото съдово съдържание на протеините еластин и колаген тип IV. Еластиновите фибри се увреждат, като те не могат да бъдат заменени от новосинтезирани, поради факта, че еластиновата продукция е почти спряна при възрастните индивиди. Вместо това се синтезира повече колаген, което намалява количеството еластин сравнено с това на колагена и тези промени водят до повишена ригидност на съдовата стена. В резултат на тези деградационни процеси, протичащи в екстрацелуларния матрикс, в серума се освобождават разтворими еластинови и колагенови пептиди, които се появяват в циркулацията.

Серумните нива на тези деградационни продукти оказват влияние както върху еластиновия, така и върху колагеновия метаболизъм, защото циркулиращите еластинови и колагенови пептиди имат имуногенни свойства и индуцират продукцията на специфични антитела: анти-еластинови и анти-колагенови антитела. Тези антитела могат да реагират с антигенните детерминанти на изменените еластинови и колагенни фибри, като по този начин се формират антиген-антитяло комплекси in situ[12].

Промените в структурата на съдовата стена при диабет водят до интимална пролиферация и задабеляване на базалната мембрана. От своя страна тези процеси допринасят за развитието на микроваскуларни усложнения[13].

Ендотелът при диабетиците е значително по-уязвим за развитието на атеросклеротични плаки, в сравнение с хората без диабет. Наличието на хипертония също нарушава ендотелнта функция, водейки до повишен оксидативен стрес[14]. При захарният диабет нарушената вазодилатация е резултат от намаленото произвеждане на азотен оксид (NO), а също така и от намалената NO активност. Ендотелната дисфункция, заедно с нарушенато NO освобождаване се срещат както при ИЗЗД, така и при НИЗЗД. Присъствието на AGEs, независимо от NO дисфункция уврежда ендотела[15].

В настоящето проучване използвахме свойството на КИФ-ELISA да открива и абсорбира ЦИК съдържащи различни Ig изотипи, като по този начин се премахват всички ЦИК от серумните проби. След това се използва ELISA за измерване на ЕА, които не са били включени в имунни комплекси. Нашите резултати показват, че стойностите на НЕА IgG на пациентите със съдови увреждания са значително повишени в сравнение с тези без васкуларни усложнения и здравите контроли. Значението на тази разлика е, че диабетиците от Група 1 показват патологично повишен имунен отговор към еластина и развиват васкуларни усложнения. Въпреки че, данните за пациентите от Група 2 показват нива на НЕА по-високи от тези на контролите, тези нива са по-ниски от измерените при пациентите със съдови увреждания. От голямо значение е да се проследи дали групата от пациенти с повишени нива на НЕА ще развие съдови увреждания преди пациенти без такива повишени нива на НЕА. Пациентите от Група 1 вероятно представляват “вторична“ активна фаза в развитието на съдови увреждания поради повишена синтеза на НЕА IgG. Беше установена връзка между НЕА и HbA1c (r=0.22); (p=0.04), общият холестерол (r=0.33); (p=0.05), триглицеридите (r=0.38); (p=0.03), и микроалбуминурията (r=0.41); (p=0.002).

Еластичните фибри могат да вземат участие в процеса на липидно отлагане в артериалните съдове[16]. Нашите резултати подкрепят тези данни. НЕА показаха корелация с триглицеридите и общият холестерол. Значението на липидния профил (повишени стойности на триглицериди и общ холестерол) също трябва да се подчертае[17-19]. Повишените нива на серумните триглицериди, които съдържат множество типове потенциални атерогенни липопротеини разширява картината на диабетната дислипидемия[20]. Тя е най-често срещаното отклонение при лош контрол на диабета. При пациентите с микроваскуларни усложнения свързването на триглицериди към артериалната съдова стена може да доведе до конвертиране на елстина в имуногенна форма. В настоящето проучване триглицеридите бяха завишени над нормалните стойности при пациентите с васкуларни усложнения което подкрепя тази възможност.

ЕА и ЕДП са маркери за еластинова деградация. Образуването на ЕА от имуната система е динамичен процес, като част от тези антитела се консумират  чрез свързване с ЕДП докато другите се намират несвързани в циркулацията. Ние наблюдавахме най-високи нива на НЕА при пациентите със съдови усложнения и поради това формулирахме хипотезата, че НЕА IgG отбелязвзт по-късна “вторична“ активация на деградационният процес.  Образуването на ЕДП, НЕА и еластин-антиеластин имунни комплекси може да играе важна роля в началото и прогресирането на късните усложнения на захарният диабет.Серумните нива на НЕА корелират със стойностите на общият холестерол и триглицеридите. Ето защо предполагаме, че НЕА IgG играят роля и в акцелерирането на атерогенезата при диабетици с артериална хипертония. Оценката на ролята на НЕА като автоантитела изисква още проучвания.

Използвана литература:

1. American Society of Hypertension Writing Group, The journal of clinical hypertension Bakris G et al., 2008
2. Moser M, High blood pressure and diabetes- Control them and live longer, www.hypertensionfoundation.org
3. Grossman E, Messerli FH., Adv Cardiol. 2008;45:82-106. doi:10.1159/0000115189.Hypertension and diabetes.
4. Najarian RM et al. (2006) Metabolic syndrome compared with type 2 diabetes mellitus as a risk factor for stroke: the Framingham Offspring Study. Arch Intern Med 166: 106–111
5. Nicoloff G, Baydanoff S, Stanimirova N, et al. Relationship between elastin-derived peptides and the development of diabetic microvascular complications—a longitudinal study in children with type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus Gen Pharmacol 2000;35:59–64.
6. Nicoloff G, Baydanoff S, Stanimirova N, et al. An association of anti-elastin IgA antibodies with development of retinopathy in diabetic children Gen Pharmacol 2000;35:83–7.
7. Nicoloff G, Baydanoff S, Stanimirova N, et al. An association of anti-elastin IgA antibodies with development of retinopathy in diabetic children Gen Pharmacol 2000;35:83–7.
8. Nicoloff G, Baydanoff S, Stanimirova N, et al. An association of anti-elastin IgA antibodies with development of retinopathy in diabetic children Gen Pharmacol 2000;35:83–7.
9. Stanilova S, Slavov E. Comparative study of circulating immune complexes quantity detection by three assays—CIF-ELISA, C1q-ELISA and anti-C3 ELISA J Immunol Methods 2001;253:13–21.
10. Nicoloff G, Blazhev A, Petrova C, Christova P. Circulating immune complexes among diabetic children Clin Dev Immunol 2004;11:61–6.
11. Baydanoff S, Nicoloff G, Alexiev Ch. Age-related changes in anti-elastin antibodies in serum from normal and atherosclerotic human subjects Atherosclerosis 1987;63:267–71.
12. G.Nicoloff, P.Christova. Elastin degradation products among obese children with family history of arterial hypertension. Diabetologia Croatica 32-1, 2003
13. Gilbert RE, Rumble JR, Cao Z, Cox AJ, van Eeden P, Allen TJ, Kelly DJ, Cooper ME: Endothelin receptor antagonism ameliorates mast cell infiltration, vascular hypertrophy, and epidermal growth factor expression in experimental diabetes. Circ Res 2000, 86:158-165.
14. Aljada A. Endothelium, Inflammation and Diabetes. Metab Syndr Relat Disord 2003; 1: 3-21.
15. Wu J, Lei MX, Liu L. [Changes of endothelium-dependent vasodilation in patients with impaired glucose tolerance and type 2 diabetes]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2007; 32: 609-14.
16. Podet E, Shaffer D, Gianturco S, et al. Interaction of low density lipoproteins with human aortic elastin Atheroscler Thromb 1991;11:116–22.
17. Microalbuminuria Collaborative Study, Group; United, Kingdom. Microalbuminuria Collaborative Study Group, United Kingdom. Risk factors for development of microalbuminuria in insulin dependent diabetic patients: a cohort study: Microalbuminuria Collaborative Study Group, U.K. BMJ 1993;306:1235–9.
18. Poulsen P, Hansen K, Mogensen C. Ambulatory blood pressure in the transition from normo-to microalbuminuria. A longitudinal study in IDDM patients. Diabetes 1994;43:1248–53.
19. Mortensen H, Poulgaard P. Hvidore Study Group on Childhood Diabetes. Comparison of metabolic control in a cross-sectional study of 2,873 children and adolescents with IDDM from 18 countries. Diabetes Care 1997;20:714–20.
20. Taskinen M. Diabetic dyslipidaemia: from basic research to clinical practice Diabetologia 2003;46:733–49.

Таблица 2. Стойности насерумни несвързани EA при пациенти със ЗД тип 2 и АХ

Несвързаните ЕА при пациенти със ЗД тип 2 и АХ са статистичски значимо по-високи в сравнение с контролите (р=0.0009). Група 1 показа сигнификантно завишение на несвързани EA спрямо здрави индивиди (р=0.0003). Група 2 също показа завишение на серумни несвързани EA спрямо контролната група (р=0.001).

Фигура 1. Стойности насерумни несвързани EA при пациенти със ЗД тип 2 и АХ

Несвързаните ЕА при пациенти със ЗД тип 2 и АХ са статистичски значимо по-високи в сравнение с контролите (0.42±0.04 vs. 0.24±0.02) (р=0.0009). Група 1 показа сигнификантно завишение на несвързани EA спрямо здрави индивиди (0.41±0.02 vs. 0.24±0.02) (р=0.0003). Група 2 също показа завишение на серумни несвързани EA спрямо контролната група (0.37±0.04 vs. 0.24±0.02) (р=0.001).

Таблица 1. Клинични данни на пациентите със захарен диабет тип 2 и артериална хипертония  

Група 1- пациенти със съдови усложнения (n=67 ); Група 2- пациенти без съдови усложнения (n= 26) Контроли (n=42) Стойностите са средна ±SD

Сподели: