Вирусологична диагностика на хепатит B

Вирусът на хепатит В (HВV) е един от петте категорично доказани хепатотропни вируса, който се свързва с развитието на остър и хроничен възпалителен процес в черния дроб (хепатит)

Клиничната значимост на инфекцията с HBV се определя от възможния хроничен ход с прогресия към чернодробна цироза и хепатоцелуларен карцином (НСС). В световен мащаб хепатит В е сред водещите етиологични причини за хронично чернодробно заболяване и важна индикация за чернодробна трансплантация. По данни на СЗО повече от 2 млрд. са инфектираните с HBV в света и над 350 млн. са хроничните носители. Специфичната вирусологична диагностика на хепатит В се осъществява с рутинните серологични методи (ELISA, ELFA, CLIA, ЕCLIA) и съвременни амплификационни техники (real-time PCR).

Ключови думи: вирусен хепатит В, серологични методи, количествен HBsAg, полимеразна верижна реакция в реално време

Хепатит В е едно от най-разпространените инфекциозни заболявания в света[9].Броят на инфектираните надхвърля 350 млн. души[8,9]. Около 50% от регистрираните случаи на чернодробна цироза и 30% на хепатоцелуларен карцином са свързани с HBV. Съществуват т.нар. хиперендемични зони в света - Югоизточна Азия, Близкия Изток и Централна Африка. България се намира в зоната с интермедиерно на разпространение на инфекцията с честота около 5%. При 30% от българската популация се установяват положителни серологични маркери за HBV (antiHBctotal).

Основните пътища на предаване на инфекцията са парентерален (кръвен), полов и вертикален (майчино- неонатална трансмисия)[3,8]. В ендемичните региони перинаталната трансмисия е доминиращ път, като заразените новородени в 90% от случаите стават хронични носители[4].

Водеща роля в развитието на хепатит В-вирусната инфекция има клетъчно-медиираният имунитет[4]. HBV проявява подчертан хепатотропизъм, размножава се в хепатоцитите, но не е цитопатичен[12]. Налице е индиректно увреждане на чернодробните клетки (възпаление и некроза) чрез активиране на цитотоксичните Т-лимфоцити (ТсLy, СТL). Вирусната елиминация и степента на чернодробна увреда са свързани с имунния отговор на организма. Спектърът на изява на хепатит В е разнороден. Острият вирусен хепатит В (ОВХВ) протича с нарушение в чернодробните функции в различна степен. В 90% от случаите настъпва оздравяване, което е свързано с доживотен протективен имунитет, медииран от неутрализиращи HВsAg-специфични антитела (antiHBs) и от HВV-специфичните CD4+ и CD8+ T-клетки. Рядко може да се развие фулминантен хепатит (ФХ) с масивна чернодробна деструкция и остра чернодробна недостатъчност (ОЧН). ФХ е свързан с висока смъртност, като честотата му нараства от 1% на 2 %, при наличие на суперинфекция или коинфекция с HDV[2]. В 10% от случаите инфекцията може да придобие хроничен ход с прогресия към чернодробна цироза (ЧЦ) и хепатоцелуларен карцином (НСС)[11]. Хроничен вирусен хепатит В (ХВХВ) се дефинира като продължаващ възпалителен процес в черния дроб с персистиране на HBsAg за повече от 6 месеца (HBsAg+ >6 months)[8,12]. ХВХВ е свързан с патогенезата на хепатоцелуларния карцином (НСС)[10].

Характерна е вирусната генетична хетерогенност. Известни са 8 генотипа (А-Н) на HBV с различен преваленс и 24 субгенотипа[8]. В България доминиращ е генотип D, в Европа преобладават D и А, докато в Югоизточна Азия превалират В и С. Генотип Е е регистриран в Африка, а генотип С се асоциира с увеличен риск от фиброза, цироза и НСС. Интерес представляват HBV-мутантите, които променят хода на инфекцията и затрудняват диагностичния процес. Множество мутации със значителна честота са наблюдавани при НСС[10].

Структурна характеристика на хепатит В вируса

HBV принадлежи към род Orthohepadnavirus на сем. Hepadnaviridae. Отличава се със сложна структура, геномна композиция и репликационна стратегия и е единственият човешки хепатитен вирус с ДНК геном. Притежава частично двойноверижна циркулярна ДНК (70% ds/30% ss) с големина 3.5 kb и вирус- специфична ДНК-полимераза[12]. Двете вериги на ДНК са асиметрични, с различна дължина. Дългата (L) верига е с (-) полярност и носи пълната генетична информация, като 5' края й е ковалентно свързан с вирусната обратна транскриптаза. Непълната, по-късата верига, която е с (+) полярност, обхваща 2/3 от вирусния геном и изпълнява регулаторни функции. HBV-вирионът е с диаметър 42 nm, сферична форма, външна липопротеинова обвивка и икосаедрален нуклеокапсид (ядро, core).^2,3 По дължината на HBV DNA са разположени 4 отчасти застъпващи се гена (open reading frames, ORFs) - S, C, P , X, които кодират главните структурни и неструктурни протеини на вируса[2,3], (Табл. 1).

Табл. 1. Гени и протеини, кодирани от HBV

Вирионните белтъци изпълняват антигенна функция. Трите кодиращи региона на S гена (S, preS1, preS2) кодират респективно голям (L - large), среден (М - medium) и малък (S - small) HBsAg (surface antigen), формиращ обвивката на вируса[2], (Фиг. 1). C-генът кодира ядрения протеин HBcAg, който се установява само в ядрата на хепатоцитите. От pre-C участъка на C-гена се кодира неструктурният протеин HBeAg, чието наличие в серума свидетелства за активна вирусна репликация. Останалите гени P и X кодират неструктурни белтъци - Pol с ензимна активност и Х-протеин (НВх) с регулаторна функция при вирусното размножаване и хепатоканцерогенеза. Pol-протеинът функционира като обратна транскриптаза и ДНК полимераза[12]. Кардинална особеност в репликацията на DNA вирусния геном е, че се извършва чрез ензимно-индуцирана обратна транскрипция на една междинна прегеномна RNA (pgRNA)[2,12]. pgRNA е шаблон за генериране на нови ДНК геноми чрез обратна транскрипция[5]. За HBV е характерна интеграцията на вирусния с клетъчния геном. Интегрирането на HBVDNA в хепатоцити се осъществява в хода на персистираща инфекция с HBV[13]. Геномът на HBV е намерен интегриран в генома на гостоприемника в почти всички HBV-свързани чернодробни тумори[10]. HBVDNA в хепатоцитите може да се намира под две форми: интегрирана (dsDNA, вътреядрена) или като епизома (cccDNA, ss, циркулярна, свободна, вътрецитоплазмена)[4]. Двете форми могат да съществуват в един и същи хепатоцит[13].Активната вирусна репликация е свързана с епизомалната форма, докато ниската репликация е асоциирана с интегрираната ДНК[4]. HBV свободно се придвижва в плазмата (виремия)[2].

Фиг. 1 Структура на HBV (slideshare.net)

Различават се два типа HBV: „див” (wild), който е HBеAg (+ ) и мутантен рre-core вариант, съответно HBеAg (-). HBеAg - minus HBV e установен с голяма честота при тежките форми на хепатит В, вкл. фулминантен хепатит[3].

Лабораторна диагностика на хепатит В

Функционалните чернодробни проби (ФЧП) отразяват чернодробното увреждане. При остър вирусен хепатит В биохимичната констелация включва екстремна цитолиза (ALT, AST) с хипербилирубинемия за сметка на директната фракция и позитивиране на жлъчните пигменти в урината (уробилиноген, билирубин). Доминира ALT, като обикновено отношението AST/ALT е

Фиг. 2. Вирусни маркери на HBV (pinsdaddy.com)

Широко използвани в лабораторната практика са високочувствителни имунологични методи:

▪ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - готови търговски китове ELISA и автоматизирани тестове за автоматични имуноанализатори, използващи ELFA технология ▪ ELFA (enzyme-linked fluorescence assay) - ELISA с флуоресцентно отчитане, автоматизиран тест

▪ CLIA (хемилуминесцентния имунен анализ) и ЕCLIA (електрохемилуминесцентен имунен анализ). Все повече се набляга на използването на количествени тестове за HBsAg[6]. Методът за количествено определяне на HBsAg представлява директен двустъпков сандвичев хемилуминисцентен имунен тест (CLIA). Разработените количествени анализи за HBsAg установяват трите форми на циркулиращ HBsAg синтезиран от вирусния минихромозом, както и от интегрирана HBV DNA[6].

Серологичният профил уточнява вида на хепатита и определя стадия и прогнозата на заболяването[1], (Табл. 1).

Табл. 1. Серологични маркери на HBV и тяхното значение

При ОВХВ първият маркер, който се появява в серума след HBV DNA, е HBsAg, след което HBeAg и аntiHBc IgM[2]. Персистирането на HBeAg над 2 месеца и на HBsAg над 3 месеца предсказва хронифициране на инфекцията. Трите основни антигени на HBV (HBsAg, HBeAg, HBсAg) са високоимуногенни и индуцират синтез на съответните антитела (аntiHBs, аntiHBe, аntiHBс). HBsAg и HBeAg се откриват в серума, а HBсAg само в ядрото на хепатоцита. При мутация в precore региона HBeAg не се експресира, въпреки че има репликация. Вирусна репликация е възможна дори при случаи на негативен HBsAg, което се дължи на недоловимия му нисък титър или на мутация в S гена, поради което е неустановим, въпреки високото му ниво.

Вирусни маркери на HBV

▪ HBsAg - повърхностен хетерогенен антиген, основен диагностичен скрининг маркер, намира се в кръвта на почти всички случаи на инфекция с HBV. При остър хепатит циркулира във висока концентрация в кръвта и се установява почти едновременно с покачването на ALT. Наличието му за повече от 6 месеца е индикация за хронифициране на инфекцията. Резултатът от качествения тест се дава като положителен или отрицателен[1]. При количествения тест измерването на нивата на HBsAg е стандартизирано в IU/mL. За разлика от хроничната HBV инфекция, динамиката на HBsAg корелира с намаляването на HBV DNA в острата фаза на фаза на хепатит В[7]. Повишаване нивото на HBsAg (количествено определен) предсказва реактивация на HBV инфекцията[7].

▪ HBeAg - маркер за активна вирусна репликация и висока инфекциозност[3]. Появява се в серума почти веднага след HBsAg. Загубата му е добър прогностичен белег при остър хепатит и при терапевтичен мониторинг ▪ аntiHBe - появата на тези антитела в хода на ОВХВ маркира началото на оздравителния процес. В случаите на хронична HBV-инфекция antiHBe сероконверсията е маркер за преминаване в нискорепликативна фаза. ▪ аntiHBc IgM - маркер за ОВХВ, характерно е наличието му във високи титри при остра инфекция и в нисък титър може да се открие при обостряне на ХВХВ. Изолирана детекция на аntiHBc IgM може да се установи в прозоречния период между HBsAg и аntiHBs сероконверсията и при ФХ с хепатална кома вследствие изчезване на HBsAg ▪ аntiHBc total - маркер за осъществен контакт с HBV, индикатор за минала или настояща HBV-инфекция, персистират пожизнено и са показател за разпространението на HBV инфекцията сред човешката популация[2]. ▪ аntiHBs - единствените протективни антитела, показват наличие на имунитет към HBV след преболедуване или имунизация. СЗО приема за минимален протективен титър на аntiHBs >10 mIU/mL, като препоръките са за титър >100 mIU/mL[2]. ▪ HBV DNA - индикатор за вирусна репликация и висока инфекциозност, появява се 6 седмици след началото на инфекцията и е маркер за остра и хронична инфекция[2]. Определянето на HBV DNA (viral load, IU/mL) служи основно за мониторинг на антивирусната терапия[8,11]. Възможната долна граница за определяне на HBV DNA с real time PCR е 10-15IU/mL. Установяването на HBV DNA (viral load) се базира основно на PCR (рolymerase сhain reaction). Европейската асоциация за изучаване на черния дроб (EASL) от 2009 г. препоръчва изследването на виремията да се провежда в реално време (real time PCR)[2]. При по-ниски нива на вирусна репликация чувствителността на използваните молекулярни методи е от решаващо значение за откриването на HBV DNA. СЗО от 2001 г. препоръчва виремията да се определя в интернационални единици (IU/mL) вместо копия (copies/ml)[2]. Real time PCR се прилага основно за терапевтичен мониторинг на хронична HBV инфекция. Отличава се с висока чувствителност и специфичност и представлява комбинация от амплификация и детекция в една епруветка. Рискът от контаминация е сведен до минимум, тъй като амплификацията се извършва в затворена система. Стандартизацията на количественото изследване изисква проба с известна концентрация, одобрена с интернационален стандарт на СЗО. Мониторирането на HBV DNA с real time PCR на 12 седмица от началото на антивирусната терапия е особено важно, тъй като ранния вирусологичен отговор (EVR) определя трайното повлияване („responder”) или резистентност към терапията. PCR се използва и за определя на HBV генотипа (генотипиране)[12]. Скорошни проучвания предлагат количествено определяне на HBV РНК като допълнение към HBV ДНК за терапевтичен мониторинг[11].HBV РНК е открита чрез real time PCR на нива почти толкова високи, колкото HBV ДНК.Частиците съдържащи HBV РНК присъстват в серума на инфектирани индивиди и количественото определяне на HBV РНК може да бъде клинично полезно[11]. Изследването на вирусната репликация (HBV DNA) е от особено значение за терапевтичния мониторинг (real time PCR) и установяването на окултна HBV инфекция (OBI). Ниската виремия е важна за спонтанния сероклирънс. При HBsAg (-) лица е важно да се изследват и anti HBs, освен anti HBc total, за да се изключи окултна хепатит В вирусна инфекция. Дефиницията на OBI (окултна HBV инфекция) включва налична вирусна репликация (HBV DNA) в серума при HBsAg (-) и anti HBc (+) лица. OBI протича с ниска виремия, а ccсDNA персистира в ядрото на хепатоцита в малки количества, aминотрансферазите (ALT, AST) са нормални или леко повишени и няма клинична изява[2]. При 50% от случаите с OBI, аntiHBs антителата също са позитивни, но не са биологично значими. OBI е честа при болни на хемодиализа, прогича с ниска виремия и нерядко се съчетава с HСV инфекция. Препоръчва се изследване на аntiHBc total преди започване на имуносупресивна или химиотерапия, тъй като е възможно реактивиране на OBI с аминотрансферазна активност. В определени случаи е възможно да не се установят нито HBsAg, нито аntiHBs, т.нар. „серологичен прозорец”, когато още не са се появили, или са в много нисък (недоловим) титър аntiHBs.В хода на инфекцията е възможна екзацербация - преминаване в репликативна фаза с обостряне на хроничния хепатит и увеличени стойности на АЛАТ („hepatic flare”), като липсва корелация между цитолизата и виремията[2]. Екзацербацията може да доведе до декомпенсация на чернодробното заболяване, поради което антивирусната терапия трябва да започне незабавно.

Заключение

Хепатит В е с глобален нозоареал, като 1/3 от населението на Земята е имало контакт с HBV. Съвременната вирусологична диагностика на инфекцията с HBV се основава на серологични и молекулярни методи. Серологичните тестове за доказване на специфични вирусни антигени и антитела са рутинни в лабораторната практика. При хронична HBV инфекция се използват високочувствителни PCR-базирани техники за определяне на вирусния товар (HBV DNA), генотипиране и мониторинг на антивирусната терапия. Своевременната и надеждна диагностика на хепатит В е от важно значение за терапевтичното поведение, профилактика и епидемичен контрол над инфекцията.

Използвана литература:

1. Гоцева А., Велчева Д., Габърска И., Червенякова Т. Проучване на диагностичната стойност на тест за количествено определяне на HBsAg. Наука Инфектология/ Паразитология. 2/2014, 17-19. 2. Кръстев. Н. Хронични вирусни хепатити. П., 2011. 3. Мечков Г. Вируси и хронични вирусни хепатити. С., 2001. 4. Попиванова Н., Балтаджиев И. Хепатит В вирусна инфекция – патогенетични аспекти и фактори на хронифициране. В: Хронични заразни заболявания. Отг. Ред. П. Георгиев. Изд. Мед. и физ., С., 2010,61-75. 5. Beck J, Nassal M. Hepatitis B virus replication. World J Gastroenterol. 2007;13(1):48–64. 6. Cornberg M. et al. The role of quantitative hepatitis B sueface antigen revisited. J Hepatol. 2017 Feb; 66(2):398-411. 7. J. Jaroszewiczn et al. Hepatiist B surface antigen (HBsAg) levels in the natural history of hepatitis B virus (HBV) infection: a European perspective. J. Hepatol. 2010. 8. Lok AS, McMahon BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology.2001;34;1225-1241. 9. Maddrey WC. Hepatitis B: an important public healt issue. MedVirol. 2000;61:362-366. 10. Mani SK., Andrisani O. Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma and Hepatic Cancer Stem Cells. Genes (Basel). 2018 Mar; 9(3):137. 11. Prakash K. et al. High serum levels of pregenomic RNA reflect frequently failing reverse transcription in hepatitis B virus particles. Virol J. 2018; 15: 86. 12. Seeger, C. et W. Mason. Hepatitis B virus biology. Microbiol.Mol.Biol. Rev.,64,2000,51-68. 13. Shafritz D. et al. Integration of Hepatitis B Virus DNA into the Genome of Liver Cells in Chronic Liver Disease and Hepatocellular Carcinoma - Studies in Percutaneous Liver Biopsies and Post-Mortem Tissue Specimens. N Engl J Med. 1981; 305:1067.

Д. Велчева¹, А. Гоцева²

¹МДЛ „Цибалаб” - София

²Лаборатория „Вирусология”, Военномедицинска академия - София

Сподели: